牛副流感病毒 3 型（BPIV-3）核酸检测试剂盒说明书

牛副流感病毒 3型（BPIV-3）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

【产品名称】

商品名称：牛副流感病毒 3 型（BPIV-3）核酸检测试剂盒（荧光 PCR法）

Name：Bovine Parainfluenza Virus type 3 Detection Kit(Real-Time PCRMethod)

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

牛副流感病毒 3 型（BPIV-3）为单股负链 RNA病毒，是引起牛呼吸道疾病综合征的重要病毒性病原之一。BPIV-3感染牛后会引起成年牛和犊牛的肺炎、支气管炎和被感染肺叶的病变。临床上主要表现为发热、流泪、流鼻涕和呼吸加快等症状^[1-2]。

本试剂盒适用于检测的牛肺部病变组织和牛鼻拭子等标本中牛副流感病毒 3 型RNA，适用于牛副流感病毒 3 型感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对牛副流感病毒 3型基因保守区特异性引物，结 合一条特异性探针，用荧光PCR技术对牛副流感病毒 3型基因保守区的 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

捕杀牛：取肺部病变组织，5g；活牛：用灭菌棉拭子沾取牛鼻腔分泌物，然后置于装有0.5mL生理盐水的 离心管中。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不 超过 3 次。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；咽拭子样品直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

1.2 核酸提取

推荐采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 10 份，多配制 1份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（QuencherDye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline的 Start 值、End值以及 Threshold 值（用户可根据实 际情况自行调整，Start 值可设在3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样本检测结果无Ct 值，且无特异性扩增曲线；

可疑：样本检测结果 40＜Ct 值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为40<Ct 值≤45，且曲线有明显的增长 曲线，判定为阳性，否则为阴性。

5.3 质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6. 检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完quan混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 张欣欣. 牛副流感病毒 3 型实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立[J].内蒙古农业大学,2016

[2] 董秀梅, 朱远茂, 蔡虹, 等. 牛副流感病毒 3型 TaqMan 实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 中 国兽医科学, 2015.