犬瘟热病毒（CDV）核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）

【产品名称】

商品名称：犬瘟热病毒（CDV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR法）

Name：Canine Distemper Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

犬瘟热是由犬瘟热病毒(CanineDistemperVirus,CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。该病广泛分布于世界各地，是当前危害犬群最严重的疫病之一，对其它犬科动物、鼬科动物和猫科动物也具有较大危害。CDV感染临床症状，根据病毒种属、环境因素以及个体对感染的反应不同而轻重不同。临床症状主要局限于上呼吸道，所以咳嗽、流鼻涕会很明显。未经免疫的幼犬很可能出现严重症状，如肺炎、腹泻、脱水、厌食等^[1]。犬瘟热的传染性极qiang，且发病率高，常常可引起大批量的犬、貂、狐及部分野生动物发病，致死率可达30%-80%，给毛皮动物产业和野生动物保护业造成了重大经济损失。目前，本病缺乏特xiao的治疗方法，早期诊断及早使用抗血清是治疗该病的重要措施。

本试剂盒适用于检测的犬肝、脾、肺等组织、血液、血清、泪液、鼻液、唾液、粪便等标本中犬瘟热病毒RNA，适用于犬瘟热病毒感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR技术，设计一对犬瘟热病毒特异性引物，结合一条特异性探针， 用荧光 PCR技术对犬瘟热病毒的 RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12个月。

【适用仪器】

ABI7500 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死犬可采集肝、脾、肺、等组织；活犬可采集血液、血清、泪液、鼻液、唾液、粪便。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不 超过 3 次。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g 离心15min，收集上清液待检。口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞沉淀待检。

1.2 核酸提取

采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 10 份，多配制 1份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（QuencherDye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline的 Start 值、End值以及 Threshold 值（用户可根据实 际情况自行调整，Start 值可设在3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样本检测结果无Ct 值，且无特异性扩增曲线；

可疑：样本检测结果 40＜Ct 值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为40<Ct 值≤45，且曲线有明显的增长 曲线，判定为阳性，否则为阴性。

5.3 质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6. 检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完quan混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。