【产品名称】兔黏液瘤病毒(RMV)PCR试剂盒
【包装规格】 50T/盒
【产品方法】实时荧光PCR法
【预期用途】
适用于检测,可用于临床兔黏液瘤病毒(RMV)感染的辅助诊断,但不作确诊使用。
兔黏液瘤病毒(RMV)PCR试剂盒【检验原理】
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,设计一对兔黏液瘤病毒(RMV)特异性引物,结合一条特异性探针, 利用相应仪器对 PCR 过程进行实时监测,实现检测结果的定性分析,用于临床上对可疑感染者的病原 学诊断。
【主要组成成份】
反应液、酶液、阳性质控品、阴性质控品。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【保存和运输】 上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输, 严禁反复冻融。
【使用方法】
1 样品处理(样本处理区)
1.1样本前处理
血液、体液和棉拭子样本取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
1.2 核酸提取
推荐采用核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取, 请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管 数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表: 试剂 RP反应液 酶液 用量(样本数为 N) 20μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21μL/管。
3.加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短 暂离心。
4.PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL; 荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光,选择 None 即可。
4.3推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
2.结果分析判定
2.1 结果分析条件设定 设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像 调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
2.2 结果判断 阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线; 可疑:检测通道 35值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35值≤38,且曲线有明显的增长曲线, 判定为阳性,否则为阴性; 阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
3.质控标准
阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示; 阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
4.检测方法的局限性
1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
2.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
3.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
4.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
5.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
6.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
7.本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1.所有操作严格按照说明书进行;
2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完quan混匀并短暂离心;
3.反应液应避光保存;
4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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