禽传染性支气管炎病毒(AIBV)核酸检测试剂盒(荧光PCR 法)

【产品名称】

商品名称：禽传染性支气管炎病毒(AIBV)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法）

Name ：Avian Infectious Bronchitis Virus Detection Kit（Real-Time PCRMethod）

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于检测的气管渗出物、支气管和肺组织、肾脏或输卵管等标本中禽传染性支气管炎病毒RNA， 适用于禽传染性支气管炎病毒感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒用对禽传染性支气管炎病毒基因保守区设计特异性引物和探针，用一步法荧光RT-PCR 技术对禽传 染性支气管炎病毒 RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

对于急性呼吸道型的病禽，应采取气管渗出物，对于刚捕杀的病鸡则采取支气管和肺组织。

对于肾型和产蛋下降型的病鸡，应采取发病鸡的肾脏或输卵管，也可从大肠，尤其是盲肠扁桃体或粪便分离病毒，但从消化道分离到的病毒未必与现流行或发生的病毒有直接关系。

其他样品采集可参照 GB/T23197-2008。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24h；若需长期保存，应放置 −70^∘C 以下保存，冻融不 超过 3次。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

被检样品，所采集的病料（肺，肾或支气管等组织样品，棉拭子）应新鲜，或者置于_−20^∘C 或 .70^∘C 低温冰箱 保存。

组织样品的处理：往 1g~3g 肺脏或肾脏等组织样品中加灭菌的0.85%生理盐水研磨成5 倍~10 倍悬浮液，反 复冻融 2 次~3 次后，以 4000g离心 10min，取上清液作核酸提取用。

棉拭子的处理：将棉拭子充分捻动拧干后除去拭子，0.5mL样品液经 4000g离心 10min，取上清液作核酸提 取用。

其他样品前处理可参照 GB/T23197-2008。

1.2 核酸提取

采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR反应管管数为 N（N=样本数+1管阴性对照+1 管阳性对照；反应管 数每满 10 份，多配制 1份），每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，

短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择：检测通道（ReporterDye）FAM，淬灭通道（QuencherDye）NONE，ABI系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline的 Start 值、End值以及 Threshold 值（用户可根据 实际情况自行调整，Start 值可设在3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样本检测结果无 Ct 值，且无特异性扩增曲线；

可疑：样本检测结果 40＜Ct 值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为40<Ct 值≤45，且曲线有明显的增 长曲线，判定为阳性，否则为阴性。

5.3 质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6. 检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完quan混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 国家质量监督检验检疫总局.GB/T23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术[S].北京:中国标准出版社, 2008.

[2] 杜雄伟,李叶,张雪.传染性支气管炎病毒实时荧光 PCR检测方法的建立[J]. 食品科学, 2012, 33(24): 219-221.