犬细小病毒(CPV)核酸检测试剂盒(荧光PCR 法)

【产品名称】

商品名称：犬细小病毒(CPV)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name ：Canine Parvovirus Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

犬细小病毒（CanineParvovirus,CPV）可引起犬的剧烈呕吐、出血性肠炎、脱水、白细胞减少和心肌炎等症状。临床上犬细小病毒病可分为肠炎型和心肌炎型，对犬造成很大危害。CPV 有 3种亚型，主要是在 VP2 蛋白 上有基因差异，即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c[1]。感染 CPV的犬主要通过粪便向外排毒，因此粪便是犬间传递 感染的主要传染源。CPV常规检测方法主要有bing毒分离鉴定、血凝和血凝抑制试验、ELISA 和PCR等方法。PCR 法灵敏度高、特异性强、操作简单，已被广泛用于 CPV诊断[2-3]。

本试剂盒适用于检测样本中的犬细小病毒，用于犬细小病毒感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR技术，设计一对犬细小病毒特异性引物，结合一条特异性探针， 用荧光 PCR技术对犬细小病毒的 DNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死犬可采集淋巴结、脾、肺、等组织；活犬可采集血液、血清、粪便等。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不 超过 3 次。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；咽拭子样品直接取 100μL 于1.5mL 灭菌离心管中。

1.2 核酸提取

推荐采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 10 份，多配制 1份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（QuencherDye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline的 Start 值、End值以及 Threshold 值（用户可根据 实际情况自行调整，Start 值可设在3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样本检测结果无 Ct 值，且无特异性扩增曲线；

可疑：样本检测结果 40 < Ct值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为 40<Ct 值≤45，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性。

5.3 质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6. 检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阻性或定量检测不准确的结果

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完quan混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] Wang S J, Yang S T, Cheng C F, et al. Isolation andidentification of canine parvovirus and sequence analysis of it VP2 gene[J]. Progress in Modern Biomedicine, 2009, 10, 26.

[2]李英俊, 史利军, 李刚, 等. 犬细小病毒荧光定量 PCR检测方法的建立与评价[J]. 中国兽医学报,2010, 30(12): 1594-1597.

[4]国家质量监督检验检疫总局. GB/T 27533-2011 犬细小诊断技术[S].

[3]刘海防, 胡传伟, 谢之景, 等. 犬细小病毒 Taqman荧光定量 PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医学报, 2010, 29(1): 36-40