氟苯尼考pcr检测试剂盒说明书

                       氟苯尼考快速检测试剂盒使用说明书

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测牛奶和水产等样本中的氟苯尼考，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行，样本中的氟苯尼考和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗氟苯尼考抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的氟苯尼考含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出氟苯尼考含量。

【试剂盒技术指标】  

规       格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.1 ppb

检测时间： 45min

样本检测下限：

组织（鸡/猪/鸭/鱼/虾/肝脏）………………0.3ppb

蜂蜜/蛋类……………………………………0.3ppb

饲料…………………………………………1.2 ppb

血清…………………………………………2ppb

交叉反应率

氟苯尼考……………………………………  100%

氟苯尼考胺………………………………………15%

氯霉素………………………………………< 0.1%

甲砜霉素……………………………………< 0.1%

回收率

组    织  ………………………………85±10%

血    清  ………………………………80±10%

蜂    蜜  ………………………………80±10%

饲料/蛋类……………………………75±10%

【试剂盒组成】  

1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）

2、 标准液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 高浓度标准品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶标记物     7ml………………… 红色帽

5、 抗体工作液  7ml………………… 绿色帽

6、 底物A液     7 ml…………………棕色帽

7、 底物B液     7 ml …………………黑色帽

8、 终止液     　7 ml …………………黄色帽

9、 20X浓缩洗涤液40 ml……………白色帽

10、 2X浓缩复溶液 50 ml ……………蓝色帽

【所用仪器、试剂】  

具备的仪器：具备的仪器：微孔板酶标仪、氮气吹干装置（样品浓缩仪）、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：单道 20ul～200ul、100ul～1000ul

多道 250 ul

试        剂： 乙酸乙酯、正己烷、去离子水

【实验前溶液配制】

配液1、将2X浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释

（1 份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本的复溶。

配液2、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子

                 水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去

                离子水），或按 所需用量配制洗涤液。

【样本前处理步骤】  

样本处理前须知

处理任何样本时，都必须注意：

（1）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、猪、牛、羊、兔、鱼、虾等。

（2）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（3）实验之前须检查各种实验器具是否干净，

必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

样本处理方法

（a）组织（鸡/猪/鸭/鱼/虾/肝脏）样本处理方法：

1.     用均质器均质组织样本；

2.     称3±0.05g样本于离心管中，先加入3ml去离子水充分混匀再加入6ml乙酸乙酯，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；

3.     取出2ml上层液体在50-60℃下氮气/空气吹干或旋转蒸发仪蒸干

4.    加入1 ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml稀释后的复溶液强烈振荡30s，室温4000r/min以上离心15min。

5.    取50 µl下层相用于分析。

      样本稀释倍数：1倍    

（b）蜂蜜/蛋类

1、 取2±0.05 g样本，放入离心管中；

2、 加入6ml乙酸乙酯上下振荡5min；

3、 室温4000r/min以上离心10min；

4、 取3ml上层清澈液到另一离心管中，50-60℃氮气流下干燥

5、 用1ml稀释后的复溶液溶解，混合30s；

6、 取50 µl用于分析。

样本稀释倍数：1    

（C）饲料

1、取2±0.05 g样本，放入离心管中；

2、加入8ml乙酸乙酯上下振荡5min；

3、室温4000r/min以上离心10min；

4、移取4ml上层清澈液到另一离心管中，50-60℃氮气流下干燥；

5、加入1 ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml稀释后的复溶液强烈振荡30s，室温4000r/min以上离心15min。

6、取50 µl取150 µl稀释后的复溶液溶解，混合30s；

7、取50 µl与用于分析。

样本稀释倍数：4

（d）血清样品处理方法（样本稀释倍数: 20 倍）

1、取出50μl血清与950μl已稀释后的复溶液，混30s；

2、取50 μl 用于分析

【酶标免疫分析程序】  

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶标记物50µl/孔,然后加入抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 显色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

7、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。

【结果判定】  

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与氟苯尼考的含量成负相关。

1、粗略判定：

   用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.2，样本2的吸光度值为0.8，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.915； 0.1ppb为1.438；0.3ppb为1.013；0.9ppb为0.602；2.7ppb为0.243；8.1ppb为0.132。则样本1的浓度范围是2.7ppb-8.1ppb; 样本2的浓度范围是0.3ppb-0.9ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氟苯尼考实际浓度。

2、定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以氟苯尼考标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氟苯尼考实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大

量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

        0.1                 0.3                0.9                  2.7               8.1

(ppb) [µg/kg]

图1：氟苯尼考检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

    0        0.1          0.3            0.9           2.7           8.1

(ppb) [µg/kg]

图2：氟苯尼考检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出氟苯尼考检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应氟苯尼考浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】  

7、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

8、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

9、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

10、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

11、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

12、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

13、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

14、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。